本发明属于基因工程技术及其应用领域,为了解决目前缺乏抗TMV的高效RNAi纳米制剂,且药剂制备过程繁杂,dsRNA的稳定性及递送效率差等问题,提供了一种RNAi纳米制剂及其制备方法和在TMV防治中的应用,该RNAi纳米制剂由dsRNA和壳聚糖纳米材料制备而成,其中:dsRNA为筛选所得长度为313bp的高抗TMV的RdRP3基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述壳聚糖和1μg/μl的dsRNA的体积比是10:(1~6)。本发明的RNAi纳米制剂能够使dsRNA的稳定性更强,持久性更好,同时具有生物相容性好、生物可降解性好、对作物无药害、环境友好型等优点,在TMV病毒防治领域具有良好的应用前景。