本发明公开一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒,该试剂盒包含:针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQ ID NO:1序列设计的上游引物P1,该P1的3’末端倒数第一个碱基与SEQ ID NO:1第1454位碱基相同,其3’末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO:1第1453位碱基相同;针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO:2序列设计的上游引物P2,该P2的3’末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO:2第1891位碱基相同;针对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列第1971~10991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。本发明的试剂盒,可快速、简便、准确地区分鸭坦布苏病毒自然感染强毒和弱毒疫苗免疫毒株,其特异性强、灵敏度高、重复性好,对于鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株的临床广泛应用具有重要意义。