本发明公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白的方法,包括将按照优化设计的HPV 16 L1基因装入表达载体,转化毕赤酵母,培养转化体,获得重组的人乳头瘤病毒16型L1蛋白,该蛋白在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒;其中,所述的优化设计的HPV16 L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明的方法制备的HPV16 L1蛋白表达量高。本发明还公开了该重组HPV 16L1蛋白病毒样颗粒制成抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法。该疫苗具有较佳的活性。