本发明公开了一种单循环复制艾滋病毒样颗粒及其制备方法,该病毒样颗粒由一个多基因缺失的HIV前病毒质粒、一个CMV‑Gag/Pol表达质粒、一个Env表达质粒共转染细胞后分离筛选获得;多基因缺失的HIV前病毒质粒通过Gaussia萤光素酶基因序列替代病毒nef基因序列进行标记后具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列;病毒样颗粒用于制备以免疫动物生产诊断和治疗的单克隆抗体、作为树突状细胞的靶向疫苗、作为CD4+T细胞系体外感染和动物感染艾滋病病毒的感染源。本发明一种单循环复制艾滋病毒样颗粒及其制备方法及其应用,病毒样颗粒具有高敏感性、高安全性,并适用于无三级实验室密闭环境的不同实验室。