本发明公开了一种蚁狮小分子肽及其分离纯化方法和应用。所述蚁狮小分子肽属类I型热休克因子结合蛋白,相对分子质量为9.6kDa,等电点为4.0,氨基酸残基数是84,氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明利用离子交换技术从蚁狮中分离纯化具有抗癌活性的多肽类成分,发现其中的两个组分ALT1和ALT6对胃癌细胞MKN28具有明显抑制效应。对组分ALT6进一步利用超滤、离子交换、分子筛等技术进行分离纯化得到组分ALT614具有最高的抗癌活性,通过NCBI序列比对发现,所述蚁狮小分子肽ALT614与热休克因子结合蛋白HSBP1具有同源性,相似度50~70%。所述蚁狮小分子肽可用于制备治疗胃癌的药物。