本发明公开了一种小麦条锈病抗性性状相关的EST序列及DNA分子标记方法及其应用。针对现有技术中采用SSR标记方法鉴定小麦条锈病抗性性状存在的缺陷,本发明提供了一种小麦抗条锈病基因表达的EST序列及基于该EST序列鉴定小麦条锈病抗性的DNA分子标记方法。本发明提供小麦EST序列JK972238-94,其碱基序列如SEQ ID NO.1所示,其功能注释为重金属结合蛋白的编码序列;提供5个EST标记方法中的目标序列,分别是LS36、LSc1617、LSc18、LSc1517、LSc1718,以及各目标序列的特异性引物对。各对特异性引物均有多态性,均与抗性基因共分离,能够用于分子标记辅助育种;提供EST标记方法中的PCR反应过程控制条件。本发明的EST序列应用于小麦条锈病抗性鉴定,能够准确、快速、可靠地检测小麦条锈病抗性基因。