本发明公开了检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒及其制备方法。本发明的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒,包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、抗牛IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、封闭液、底物液和终止液,其中,所述包被酶标板是用氨基酸序列是SEQ ID No.2的牛分枝杆菌抗原包被固相载体得到的。本发明的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒具有抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等特点。利用本发明的检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒检测牛血清特异性强、灵敏度高、重复性好、适于大批量检测,可用于牛分枝杆菌抗体的临床检测。