The present invention relates to engineered penicillin G acylase (PGA) enzymes with improved properties, polynucleotides encoding such enzymes, compositions comprising the enzymes, and methods of using the enzymes. The present invention is an engineered penicillin G acylase capable of removing the A1 / B1 / B29 triphenylacetic acid protecting group from insulin to produce free insulin, comprising SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 And / or 12 and at least about 85%, about 86%, about 87%, about 88%, about 89%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95% A penicillin G acylase that is about 96%, about 97%, about 98%, about 99%, or more identical.本発明は、改善された特性を有する操作されたペニシリンＧアシラーゼ（ＰＧＡ）酵素、このような酵素をコードするポリヌクレオチド、酵素を含む組成物、および酵素の使用方法に関する。本発明は、インスリンからＡ１／Ｂ１／Ｂ２９トリフェニル酢酸保護基を除去して遊離のインスリンを生成することができる操作されたペニシリンＧアシラーゼであって、配列番号２、４、６、８、１０、および／または１２と少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超えて同一であるペニシリンＧアシラーゼを提供する。
