本发明公开了一种能同时鉴别内源性和外源性禽白血病病毒的三重PCR试剂盒,其组成包括:DNA聚合酶,dNTP,引物,PCR缓冲液,双蒸水;其特征在于:所述的引物由3对引物组成,其中,第1对引物的序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示,第2对引物的序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示,第3对引物的序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。采用本发明多重PCR试剂盒可在同一反应体系中同时检测出是否有禽白血病病毒感染,并对内、外源性ALV进行鉴别,具有较高的特异性和敏感性,从而节省时间和试剂,可以为鸡群或鸡胚的快速和早期诊断提供有效的工具。