Provided is a method for separating human testicular mesenchymal stem cells. The method comprises: digesting a testis sample, separated out by means of biopsy, of an obstructive azoospermia patient with type IV collagenase, and filtering to remove tissue lumps and after human testicular cells are obtained, using a CD51 antibody to label the testicular cells, then sorting by using a flow cytometry, separating and collecting the human testicular mesenchymal stem cells which are positive in CD51. Also provided are a method for culturing human testicular mesenchymal stem cells, and use of human testicular mesenchymal stem cells in medicines for treating related diseases caused by low testosterone level.La présente invention concerne un procédé pour séparer des cellules souches mésenchymateuses testiculaires humaines. Le procédé consiste à : digérer un échantillon testiculaire, prélevé par biopsie, dun patient atteint dazoospermie obstructive avec de la collagénase de type IV et filtrer pour éliminer des morceaux de tissu et après lobtention de cellules testiculaires humaines, utiliser un anticorps CD51 pour marquer les cellules testiculaires, puis effectuer un tri à laide de la cytométrie en flux, séparer et collecter les cellules souches mésenchymateuses testiculaires humaines qui sont des cellules CD51+. Linvention concerne également un procédé de culture de cellules souches mésenchymateuses testiculaires humaines et lutilisation de cellules souches mésenchymateuses testiculaires humaines dans des médicaments pour le traitement de maladies associées provoquées par un niveau de testostérone bas.