本发明公开一种可用于检测口蹄疫O型病毒的引物,以及用这些引物制备的检测试剂盒和制备方法。本发明的用于检测口蹄疫O型病毒的引物基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4。相关实验表明,采用本发明的引物序列可特异性快速扩增口蹄疫O型病毒的核酸,通过核酸电泳检测到特异性条带,并具有特异性。本发明能够对口蹄疫病毒进行高通量的定性、定型和定量检测。相比于其他已存在的方法和试剂盒,本发明在用于港口检疫、动物流通环节检疫以及实验室诊断均很大的优势。