本发明公开了一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用。该试剂盒包括铁皮石斛特异引物和特异探针,核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示;石斛属通用引物和通用探针核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑6所示。使用上述的荧光PCR检测试剂盒进行PCR扩增可以对铁皮石斛及石斛属植物加以鉴别。本发明以特异性荧光探针与模板配对,具有高度的特异性与专一性,并且扩增效率高,灵敏度高,准确率高,重现性好,检测周期短,能在1.5小时内完成检测,且能实时检测DNA扩增反应,具有很高的可行性与应用前景,为真正的铁皮石斛在中药市场的地位保驾护航。