本发明提供了一种快速、准确检测甜瓜种子纯度的特异性序列和方法。所述特异性序列,选自以下序列组中的一组或两组以上:SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02;SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04;一直到SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80。本发明还提供了一种甜瓜种子纯度检测的方法,包括如下步骤:(1)提取样本基因组DNA;(2)利用引物序列对样本线粒体基因组DNA进行PCR扩增和检测;(3)进行SSR多态性标记和特征条带统计;(4)计算甜瓜种子纯度。本发明首次基于甜瓜线粒体基因组父系遗传特性,开发了一套多态性较高的甜瓜线粒体基因组SSR标记,用于甜瓜种子纯度的快速检测和鉴定。