本发明涉及动物传染病技术领域。具体涉及一种重组H5N1禽流感病毒细胞苗及应用。重组H5N1禽流感病毒细胞苗包含重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株,该rC4/W1株保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:V201029,该重组H5N1禽流感病毒rC4/W1株的基因组中含有如SEQ ID NO:1-8所示的禽流感病毒的8个相关基因的片段。利用反向遗传学方法拯救出重组H5N1禽流感病毒,将该重组病毒在MDCK细胞上传代至稳定并将其灭活后作为油乳灭活苗。本发明以H9N2禽流感病毒为背景,换入H5N1亚型的禽流感病毒HA和NA基因,重组病毒所有基因片段均来自禽流感病毒,具有更好的安全性。重组H5N1禽流感病毒能在MDCK细胞上传代培养,获得高增殖滴度的毒株,克服了禽流感爆发时大量鸡胚的短缺问题。