本发明属于作物标记辅助育种技术领域,具体涉及利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法。本发明的特征包括培育耐受化学杀雄剂的父本材料和无遮挡的化学杀雄步骤。利用化学诱变剂诱变甘蓝型油菜种子,在5‑6叶期喷施除草剂苯磺隆,初步筛选得到抗除草剂的突变体材料,自交得到稳定遗传的抗除草剂油菜突变体株系,提取油菜突变体株系基因组DNA,扩增得到BnaAHAS1和BnaAHAS3基因片段,其中BnaAHAS3基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,在该基因BnaAHAS3第536bp处存在一个C/T突变。本发明还公开了抗除草剂的特异性标记的制备,以及在无遮挡化学杀雄制种中的应用。