本发明提供一种重组金黄色葡萄球菌肠毒素O的制备方法,该蛋白属于一种超抗原,具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本发明是通过构建一种可用于表达金黄色葡萄球菌肠毒素O的重组质粒,该质粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.1的核苷酸序列经过重组构建而成,初始获得的GST-SEO融合蛋白占细菌总蛋白含量的15-25%。本发明利用其超抗原活性应用于体外促脾淋巴细胞增殖以及体外抑制肿瘤细胞生长,并与金黄色葡萄球菌肠毒素C进行超抗原活性比较,证实该重组蛋白具有典型的超抗原活性,且与SEC相当。适用于高效制备具有超抗原活性的高纯度肠毒素以及超抗原制剂的开发,可在制备刺激淋巴细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。