牛轮状病毒NSP5基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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作   者：

于德斌;  曹存;  徐晓静;  于力;  常继涛; 

作者机构：

内蒙古农业大学兽医学院;  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队; 

关键词：

牛轮状病毒;  NSP5基因;  荧光定量RT-PCR; 

期刊名称：

中国预防兽医学报

i s s n：

1008-0589

年卷期：

2021 年 004 期

页   码：

399-404,424

摘   要：

为建立检测牛轮状病毒（BRV）快速特异的荧光定量RT-PCR方法,本研究针对BRV NSP5基因设计了一对特异性引物经PCR扩增目的片段,并克隆于pCI载体作为重组质粒标准品（pCI-NSP5）,经优化反应条件,建立了基于NSP5基因的BRV荧光定量RT-PCR方法,并对其进行了特异性、敏感性及重复性试验。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法最佳引物浓度为10μmol/L,模板为2μL,退火温度为58℃;特异性试验结果显示,该方法除对BRV的检测结果为阳性外,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的最低检测限为12拷贝/μL,对BRV的最低检测限为1×102TCID50/反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法检测30份BRV接种犊牛的粪便样品,结果 25份呈阳性,而利用VP7基因的常规RT-PCR和病毒分离方法检出的阳性样品分别为20份和25份,表明本研究建立的检测方法的敏感性高于VP7基因的常规RT-PCR方法,而与病毒分离方法的符合率为100%。以上结果表明,本研究建立的BRV NSP5基因荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以用于BRV的快速检测、病原流行病学调查以及疫苗免疫攻毒试验的病毒载量定量等研究。