利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系

• 全文链接
• 请求原文

作   者：

张宏民;  龙雯;  劳筱清;  陈雯妍;  商雪梅;  王洪连;  王丽;  粟宏伟;  沈宏萍;  沈宏春; 

作者机构：

西南医科大学中西医结合学院;  西南医科大学附属中医医院; 

关键词：

TCMK1细胞系;  CRISPR/Cas9技术;  Pmepa1;  纤维化; 

期刊名称：

生物技术通报

i s s n：

1002-5464

年卷期：

2024 年 40 卷 002 期

页   码：

73-79

摘   要：

[目的]利用CRISPR/Cas9 技术构建Pmepa1 基因敲除的TCMK1 小鼠肾小管上皮细胞系,并探讨Pmepa1 敲除对TGF-β刺激下TCMK1 细胞纤维化的影响,为研究Pmepa1在纤维化模型中的作用提供细胞模型.[方法]根据CRISPR/Cas9 设计原则设计靶向小鼠Pmepa1 基因组序列的sgRNA序列,构建pX333 载体并转染进入TCMK1 细胞,采用流式分选mCherry阳性细胞、单克隆细胞扩增和测序鉴定Pmepa1 敲除细胞,Western blot验证Pmepa1 基因敲除情况.采用RT-PCR和Western blot分析Pmepa1敲除对TGF-β1 诱导的R-Smad的活化和纤维化的影响.[结果]将sgRNA设计在Pmepa1 第 2 个外显子,pX333-Pmepa1 质粒转染TCMK1 细胞 48 h后,观察到mCherry荧光蛋白的表达,流式细胞分析转染效率约为 17%,pX333-Pmepa1 质粒转染阳性细胞经流式分选和单克隆扩增培养,得到 19 个细胞克隆,对Pmepa1 基因位点上sgRNA靶点序列PCR扩增测序分析发现 2 个双等位基因移码突变细胞,Western blot验证Pmepa1 蛋白表达缺失,表明Pmepa1 基因敲除TCMK1 细胞株构建成功,与未敲除细胞相比,Pmepa1敲除细胞在TGF-β1刺激下,p-Smad2和p-Smad3的表达显著升高,并且促进纤维化基因Fibronectin和Collagen I 的表达.[结论]利用CRISPR/Cas9 技术成功构建Pmepa1 基因敲除TCMK1 小鼠肾小管上皮细胞系,为Pmepa1 蛋白的功能研究建立了细胞模型以及Pmepa1在纤维化中的重要作用.